腦性癱瘓(CP)是由腦發(fā)育缺陷或非進(jìn)行性腦損傷所致，常發(fā)生在2歲以下小兒中，發(fā)病率約1~3%。兒童痙攣性腦癱常表現(xiàn)為肌肉無(wú)力、痙攣、選擇性運(yùn)動(dòng)控制喪失，以及原發(fā)性腦損傷導(dǎo)致的姿勢(shì)控制受損。

       在臨床上，腦癱患兒通常表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)馬蹄足，存在膝關(guān)節(jié)過(guò)伸、過(guò)度擴(kuò)張、三頭肌群收縮缺失等問(wèn)題。臨床上尚未發(fā)現(xiàn)根治CP的方法，雖然替代藥物經(jīng)常被使用，但并未發(fā)現(xiàn)有效證據(jù)支持其使用，一般是通過(guò)康復(fù)性治療、藥物和手術(shù)來(lái)改善患兒運(yùn)動(dòng)功能。

       本研究使用脂多糖(LPS)與缺氧/缺血(H/I)聯(lián)合誘導(dǎo)建立CP大鼠模型，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS /MS)聯(lián)合tmt-標(biāo)簽定量方法探討白脈軟膏對(duì)CP大鼠腦損傷的治療作用。

       大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只(5只雄性，5只雌性)，分別為白脈軟膏組、安慰劑組、模型組和對(duì)照組。在白脈軟膏組大鼠背部的皮膚表面(從第7天到第40天)局部涂抹奇正白脈軟膏1.5mL/只/日；在安慰劑組CP大鼠組背部皮膚表面局部涂抹安慰劑1.5mL/天(從第7天至第40天)。

       同時(shí)，研究人員要在上午8~11時(shí)評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，從出生后30~40天每5天進(jìn)行一次旋轉(zhuǎn)測(cè)試，測(cè)試系列以40rpm的速度進(jìn)行一系列測(cè)試，記錄了每只大鼠的墜落時(shí)間。最后，收集其血清、海馬和運(yùn)動(dòng)皮層樣本進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

01 CP大鼠蛋白質(zhì)的質(zhì)譜定量分析

       LC-MS/MS對(duì)海馬體的分析顯示，共有2551種蛋白質(zhì)含有2種或更多獨(dú)特的肽；在運(yùn)動(dòng)皮層中，共發(fā)現(xiàn)2521種蛋白質(zhì)，其中2種或2種以上為獨(dú)特的肽。在本研究中，海馬中發(fā)現(xiàn)了1397種改變的蛋白質(zhì)，其中582個(gè)蛋白在安慰劑組大鼠中表達(dá)下調(diào)(與正常對(duì)照組相比)，而在白脈軟膏組大鼠中表達(dá)上調(diào)(與安慰劑組相比)，還有815個(gè)蛋白表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。在大腦皮層中，發(fā)現(xiàn)了1843種改變的蛋白質(zhì)，其中564個(gè)蛋白在對(duì)照組中表達(dá)下調(diào)，而在白脈軟膏組中表達(dá)上調(diào)(與安慰劑組CP大鼠相比)，1279種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。

02利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)CP大鼠海馬蛋白功能分類

       通過(guò)信號(hào)通路對(duì)海馬體的1397個(gè)改變的蛋白質(zhì)和運(yùn)動(dòng)皮層的1843個(gè)改變的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)CP組間表達(dá)蛋白和下調(diào)蛋白的富集分?jǐn)?shù)最高。在已識(shí)別的通路中，最熱門(mén)的是海馬區(qū)細(xì)胞質(zhì)核糖體蛋白、gpcr-C類代謝谷氨酸、信息素和膽固醇代謝通路(圖1)，以及運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)絲裂原活化激酶(MAPK)信號(hào)通路和膽固醇代謝通路(圖1)。

       有趣的是，在海馬體和運(yùn)動(dòng)皮層中，與對(duì)照組健康大鼠相比，在安慰劑組CP大鼠中，各種膽固醇代謝途徑的催化酶的表達(dá)上調(diào)，與安慰劑組CP大鼠(圖1)相比，白脈軟膏組各種膽固醇代謝途徑的催化酶的表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，膽固醇合成途徑中的Hmgcs1、Idi1和sql催化酶也發(fā)生了類似的改變。運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中只有Mvd、Fdps和Dhcr7發(fā)生改變，而海馬中沒(méi)有。與安慰劑組CP大鼠相比，白脈軟膏組CP大鼠Rps6ka1表達(dá)明顯降低。同樣，第40S核糖核糖核糖蛋白R(shí)PS8、RPS9、RPS25和RPS27的表達(dá)也受到了控制。

       與對(duì)照組健康大鼠相比，Grm4表達(dá)在用安慰劑組CP大鼠中明顯上調(diào)，與安慰劑組的CP大鼠相比，白脈軟膏組CP大鼠Grm4表達(dá)明顯下調(diào)。與對(duì)照組相比，安慰劑組CP大鼠的上述蛋白表達(dá)水平下降，而白脈軟膏組CP大鼠的上述蛋白表達(dá)水平上升。

       這些結(jié)果表明，MAPK通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)受到白脈軟膏治療的影響。

03免疫化學(xué)染色

       使用免疫組化法定位大鼠海馬中CP相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖2)，與對(duì)照組相比，在安慰劑CP大鼠中，組蛋白3.3和組蛋白4的表達(dá)被下調(diào)。然而，與對(duì)照組和安慰劑組相比，白脈組CP大鼠組蛋白3.3和組蛋白4表達(dá)上調(diào)。與對(duì)照組相比，模型組CP大鼠和安慰劑組CP大鼠的PKC-δ和外周蛋白表達(dá)上調(diào)；然而，與對(duì)照組和安慰劑組相比白脈治療組CP大鼠的PKC-δ和周圍蛋白表達(dá)下調(diào)。

       使用高通量定量蛋白質(zhì)組方法，評(píng)估在脂多糖(LPS)與缺氧/缺血(H/I)聯(lián)合誘導(dǎo)的CP大鼠模型中海馬和運(yùn)動(dòng)皮層的蛋白組學(xué)變化。在每個(gè)大腦區(qū)域都發(fā)現(xiàn)了2000多種蛋白質(zhì)。定量分析顯示，LPS和H/I誘導(dǎo)之后除了運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的破壞外，海馬和運(yùn)動(dòng)皮層蛋白質(zhì)組的也發(fā)生了嚴(yán)重的紊亂。

       相比之下，白脈軟膏的局部應(yīng)用不僅緩解了CP大鼠模型的運(yùn)動(dòng)缺陷，而且恢復(fù)了大腦皮層的蛋白質(zhì)組。此外，在白脈處理的CP大鼠大腦中，海馬中的星形膠質(zhì)細(xì)胞被強(qiáng)烈激活，這與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的增加有關(guān)。

       蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，CP模型可誘導(dǎo)大腦神經(jīng)炎癥反應(yīng)，而局部應(yīng)用白脈軟膏的則逆轉(zhuǎn)了這一反應(yīng)。本研究突出了海馬和運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元在CP進(jìn)展和治療中的意外作用，從而為CP提供了潛在的新治療靶點(diǎn)。